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RNA的制备
合肥918博天堂生物科技有限责任公司 / 2015-01-27

                                                                                                                                                    RNA的制备

一、 mRNA的分离   与rRNA和tRNA不同的是,哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3’端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNA。在构建cDNA文库时, 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时,与总RNA相比,采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)-纤维素,也可以买现成的产品。 1)用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纤维素。 2)将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中, 柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)-纤维素最大量为10mg总RNA,如果总RNA的量较少,则应减少oligo(dT)-纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。 3)用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液 20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.5mol/L NaCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.1%SDS 可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液;将适量无RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌,待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 %SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。 4)用灭菌水溶解RNA,于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温,加等体积的2x层析柱加样缓冲液,上样,立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后,加1倍体积的1x层析柱加样 ,继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。 5)当全部溶液流出后,将收集液置于65℃温育5分钟,重新上样,并收集流出液。 6)用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱,分部收集洗出液,测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床, OD260会很高,后来OD260值则很小或为零。在某些方案中,上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床,然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有, 因此这一步骤可以省略。 7)用2-3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA,以1/3-1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液 10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.05%SDS用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理,因高压会使溶产生大量气泡。 8)收集液置于透明的小溶器内,测定OD260, 使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)-纤维素亲和量层析后得到的RNA中,带与不带poly(A)的RNA,其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA,可将洗脱液于65 ℃温育3分钟,迅速冷却至室温,加入NaCl至终浓度为0.5mol/L,用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。 9)收集oligo(dT)-纤维素柱层析的洗脱液,在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇,混匀,冰浴至少30分钟。 10)于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA,小心弃去上清液,用70 %乙醇洗涤沉淀(通??床患恋恚?,离心片刻,在空气中晾干核酸沉淀。 11)用少量水重溶RNA,置于比色杯内,测定OD260, 使用前比色杯须用浓盐酸:甲醇(1:1)浸泡1小时,再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗 12)将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内,加3倍体积乙醇, 混匀,于-70℃保存备用?;厥誖NA时,只需取出一小份贮存液,加3mol/K乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L, 混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。   注、1.OD260=1的溶液其RNA含量约为40μg/ml。 2.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1-5μg mRNA,所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1-2%。 3.现可直接从公司购买纯化试剂盒。  二、RNA酶活性的控制   为了获得高质量的真核细胞mRNA, 必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法,最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时,避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶法染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项,只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。   (一)实验程序   如不谨慎操作,外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA制品: (1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA〈, /SPAN〉酶,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染,使用前必须于180℃干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时,然后用灭菌水淋洗数次, 并于100℃干烤15分钟。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。上述处理可以除去器甲上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。羧甲基化的RNA在无细胞体系中翻译效率很低,然而,除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰,否则其形成DNA:RNA或RNA:RNA杂交休的能力并不明显降低。用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1 %DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。 (2)研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时,主有涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“胖的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。 (3)污染的溶液 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿??赡艿幕叭芤壕τ?.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液??纱婕钙啃碌奈纯獾腡ris晶体以制备无RNA酶的溶液。  (二)RNA酶的抑制剂 下面介绍3种广泛应用的特异性RNA酶抑制剂。 (1)RNA酶的蛋白质抑制剂是 从人胎盘分离的一种蛋白质可与多种RNA酶紧密结合(KI≈3x1010)形成非共价结合的等摩尔复合物,使RNA酶失活。此蛋白质体内可能是血管生成素的抑制剂,血管生成素是氨基酸序列和推测的三级结构与胰RNA酶类似的一种血管生成因子, 几个厂家以不同的商品名出售这种抑制剂,该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50%甘油中,贮存于-20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用,因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此,在使用变性剂裂解哺乳动物细胞这一提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而职用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂,并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂,故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂,而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。 (2)氧钒核糖核苷复合物 这种由氧钒(1V)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是量种过渡态类似物,它能与多种RNA酶结合并几科能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译, 并能作为某些外酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1%羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有几家公司出售氧钒核糖核苷复合物。 (3)Macaloid(硅藻上)Macaloid是一咱粘土,很多年前就发现它能吸附RNA酶,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。 (三)破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法   用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质, 导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等,因此可联用上述试剂,从组织中,如富含RNA酶的胰腺中,提取完整无损的RNA。下述实验程序系列利用RNA酶抑制剂和(或)能迅速灭活RNA酶的有关方法从组织或细胞培养物中分离总RNA、核内RNA和胞质内RNA。这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序系为Favaloro 等(1980)所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA。但不适用于从固体组织中提取RNA,因为用这种裂解细胞的方法(在SDS存在的条件下用蛋白酶K消化)去消化组织速度很慢,导致内源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。原方案中(Favaloro等。1980)采用的裂解缓冲液含有0.015 %(W/V)的Macaloid(硅藻土),用于吸附并灭活RNA酶。尽管现仍有Macaloid出售NL Chemicals), 但氧钒核糖核苷复合物和RNA酶的蛋白质抑制剂更常用。下述程序的优点是速度快,并能同时处理很多样品。   A、细胞裂解  a.单层细胞的裂解 a)吸出培养液,以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞,重复1次,将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上,再将铝板置于冰盘上。 b)直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液, 并使之遍布整个平板的表面。 RNA提取缓冲注液 0.14mol/L NaCl 1.5mmol/L MgCl2 10mmol/L Tris.Cl(pH8.6) 0.5%NP-40 1mmol/L二硫苏糖醇(DTT) 100单位/ml胎盘RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物 c)加0.5ml蛋白酶消化缓冲液,用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。 蛋白酶消化缓冲液 0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 0.3mol/L NaCl 2% SDS d)用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物,再将其注入聚丙烯管内。重复3-4次,剪切DNA。 c)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟。 蛋白酶K以贮存液的形式保存,贮存液为20mg/ml 蛋白K溶液。 b.悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解 a)于4℃以2000g离心5分钟收集细胞,以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀,洗涤细胞3次,每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀,使其彻底分散。 b)估计细胞沉淀的体积,用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。 c)加入与步骤b)所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液,用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物,再将其注入聚丙烯管内。重复3-4次,剪切DNA。 d)加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存,贮存液为20μg/ml蛋白酶K水溶液。B、提取步骤 1)用等体积酚:氯仿抽提1次,以去除蛋白质。 2)用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相, 将水相吸至一个新的离心管内,加2.5倍体积用冰预次序的乙醇,充分混匀, 于0℃放置1小时。 3)于0℃以5000g离心10分钟沉淀RNA,弃上清,用含0.1mol/L 乙酸钠(pH5.2)的70%乙酸洗涤沉淀,用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽, 随后于室温放置几分钟,晾干沉淀。切勿抽干沉淀,因为干的核酸沉淀很难溶解。 4)每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。 5)分别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇(DTT),然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。 6)加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2μg/ml,混匀,于37℃温育60分钟。 7)分别按10mmol/L和0.2%的终浓度加EDTA和SDS。 8)用等体积酚:氯仿抽提1次。 9)于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相, 将水相吸至另一个离心管内,加3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L,加2.5倍体积用冰预次的乙醇,充分混匀,冰浴放置2小时。 10)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟沉淀RNA。 11)吸出所有的乙醇,将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟,让最后残存的痕量乙醇挥发干净。 12)用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加500μl乙醇,于-70 ℃贮存备用?;厥誅NA时,只须取出1小份贮存液,加入3mol/L乙酸钠(pH5.2 )至终浓度为0.3mol/L,充分混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。 C、注意事项 1.测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液离心沉淀RNA,以400水重溶, 测定OD260 值, OD260=1的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。 2.如果需要,可用oligo(dT) -纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。 3.某些情况下(例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时),必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则,当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题, 反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物,从而导致物定mRNA5’末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。 a)步骤12后,加200μl 3mol/L乙酸钠(pH5.2),用自动微量移液器反复吹吸,以重悬核酸沉淀,将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。 b)用微量离心机于室温以12 000g离心10分钟,RNA沉于管底,而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。 c)弃上清液,用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠(pH5.2),分混匀,加入550μl用冰预冷的乙醇?;煸热芤?, 在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于4℃以12 000g离主10分钟,以回收RNA。小心吸出上清。d)弃上清液,用300μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加1ml乙醇,-70℃贮存备用。 回收RNA时,只需取出1小份贮存液,加3mol乙酸钠(pH5.2 )至终浓度为0.3mol/L充分混匀,用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物,用含0.1%羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]将RNA终溶液抽提数次即可。 4. 对大多数细胞株来说, 一个直径90mm 培养甲中培养的RNA收率为100-200μg。用异硫氰酸胍和有机溶剂提?。遥危?  收集细胞,离心5000r/min ,5分钟,弃上清,加入异硫氰酸胍变性液(异硫氰酸胍4mol/L;柠檬酸钠25mmol/L,Sarkosy10.5%,β-巯基乙醇0.1mol/L)500ml,混匀,振荡10秒,加2 mol/L醋酸钠50ml,水饱和酚500m l和氯仿/异戊醇(49:1)100m l颠倒混合数秒钟,冰浴15分钟,4℃离心10,000 r/min,15分钟,吸取上清,加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇,, 4℃离心10,000 r/min,10分钟,弃上清,70%酒精洗涤一次,抽干,加35mlDEPC处理水溶解,取5ml经稀释后紫外测定RNA提取量,其余30ml分装,-20℃保存备用。