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全基因合成常见问题解答
合肥918博天堂生物科技有限责任公司 / 2015-03-02

 

                                                                               全基因合成常见问题解答
 
1.碱基序列对全基因合成的影响 
1. 长片段重复。大量的长片段重复很可能会延长基因合成的时间,甚至导致基因完全无法合成。 
2. 高GC%?;蚰诓康木植扛逩C%会严重影响PCR扩增和测序。 
3. 二级结构。碱基序列的反转、重叠等会严重影响PCR扩增,在测序时也可能会因此而测不通或信号突然中断等。 
4. 测序引物与基因内部的特殊序列结合导致无法正常测序,必须重新设计测序引物。 
对策: 对密码子进行优化,尽量减少基因序列中的重复序列,高GC%区和二级结构区。 
 
2.PCR出现非特异性扩增带 
1. 引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。 
2. Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多。 
3. 酶量过多出现非特异性扩增。 
对策: 
1. 重新设计引物。 
2. 减低酶量或调换另一来源的酶。 
3. 降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。 
4. 适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性,65左右退火与延伸)。 
 
3.PCR出现片状拖带或涂抹带 
1. 酶量过多或酶的质量差。 
2. dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多。 
对策: 
1. 减少酶量,或调换另一来源的酶。 
2. 减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度,减少循环次数。 
 
4. DNA没有被限制性内切酶切开或者切割不完全 
1. 缺少识别序列。 
2. 反应条件不合适。 
3. 限制性内切酶对DNA甲基化敏感。 
4. 内切酶稀释不正确或加入方法不正确。 
5. 甘油浓度过高。 
6. 限制性内切酶已部分或全部失活。 
对策: 
1. 检查底物DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。 
2. 使用随酶提供的反应缓冲液;增大酶量。 
3. 检查DNA是否已被甲基化以及所用的限制性内切酶是否对甲基化敏感。 
4. 限制性内切酶经稀释缓冲液稀释后应在当天用完;限制性内切酶通常在最后加入。 
5. 更换新酶进行实验。 
6. 酶的体积不能超过反应总体积的1/10。 
 
5.电泳后电泳条带扩散,电泳条带移动距离异常 
1. 底物DNA不纯。 
2. 限制性内切酶不纯。 
3. 酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常。 
对策: 
1. 用另外一种限制性内切酶与底物DNA温育作为对照 
2. 用产品说明中的底物DNA来检测酶活性,如果电泳后条带仍扩散,说明不正确的操作已使内切酶污染。 
3. 电泳前用终浓度为0.1%的SDS在65与底物DNA温育10min。 
 
6.连接效率不高 
1. 连接缓冲液已变质。 
2. 限制性内切酶在连接混合物中仍具活性。 
3. 非特异性的核酸酶污染。 
4. 连接酶浓度太低。 
对策: 
1. 用新鲜的连接缓冲液重新进行连接反应。 
2. 如果限制性内切酶在65温育下热稳定,酶切后应该用酚来去除去蛋白并用乙醇沉淀DNA。 
3. 判断连接反应混合物中哪种组分被污染,然后逐一将其替换。 
4. 在连接反应中增大连接酶的用量(0.3-0.6 Wu/1μg),并同时使用10%PEG。酶切后用酚抽提底物DNA中的蛋白。 
 
7.质粒及其菌株的运输保存 
我们为您提供含有完全正确的基因序列的质粒(不少于1ul)、甘油菌(含40%甘油)和穿刺菌各一份。在运输过程中,质粒、甘油菌和穿刺菌均须保证低温运输。在实验室内,穿刺菌应在0~4保存;甘油菌应在-70以下保存;质粒应在-20以下保存,并尽量避免反复冻溶。